• 基本的な注意
• 前日までの準備
  • 器具の滅菌
  • 試薬の作成
    • A. 室温保存
    • B. 冷凍保存
    • C. 冷蔵保存
  • 胚の固定
• 一日目午前試薬作り
• 一日目午後
  • 前処理
  • ProK treatment
  • Hybridization
• 二日目午前　試薬準備
• 二日目午後　PROBE 回収
• 三日目

1. RNase の汚染が無いように厳重注意
2. 器具は全て滅菌か使い捨て容器使用
3. 操作は必ず手袋着用、特にサンプルチューブは素手で触らない。
4. 試薬の量と条件（温度など）を間違えないこと

RNase free

• dH2O 1l
• PTw 2l
• TAE 200ml
• 20X SSC 50ml
• Hybridization Buffer
• 10% tween
• 10% chaps
• Proteinase K

Others

• 2 x SSC 500ml
• 0.2 x SSC 300ml

前日までの準備

• 器具の滅菌
  ガラス器具　乾熱滅菌
  プラスチック容器（主に使い捨て）
• 試薬の作成
  ラベリング
  作った試薬には試薬名と調製日を書いておく。
  スペースがあれば、制作者名（もしくはイニシャル）も記入
• 胚の固定
• その他の実験条件
  実験室　Wash まではRNase を使用している部屋は使わない。
  手袋　　Wash まではサクラメンの手袋着用。
  温度　　Hybridization, Wash の温度は厳守、試薬はあらかじめ所定の温度にしておく

1. DEPC DW(DEPC H2O)
   2L くらい作っておく
   DW
   DEPC 0.1% (1ml/l)
   Stir over night
   autoclaved
   
2. 10× PBS for 1l
   

   NaCl	Sodium Chloride 塩化ナトリウム	58.44	1369mM	80g
   KCl	Potassium Chloride 塩化カリウム	74.55	26.8mM	2g
   Na2HPO4	Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous リン酸一水素ナトリウム（無水）	141.96	81.0mM	11.5g
   KH2PO4	Potassium Phosphate, Monobasic リン酸二水素カリウム（無水）	136.09	14.7mM	2.0g
   H2O				800ml

   
   adjust the pH to 7.4 then make up to 1l

   autoclave
   

3. PTw for 1l RNase free 2lくらいつくっておく
   

   10× PBS	100ml
   10% Tween 20	10ml(0.1%)

   autoclave after DEPC treatment
   
   
   
4. PBT (BSA-) Final RNase free MAB Buffer を使うときはいらない
   

   10× PBS	1l
   Triton(10%)	10ml (0.1%)
   BSA	2g (2mg/ml)使用直前に加える

   
   
   
5. MAB(Maleic acid buffer) antibody wash用のBuffer
   

   Maleic acid	116.1	100mM	11.61g
   NaCl	58.44	150mM	8.77g
   H2O			make up to 1l

   
   pH to 7.5 with 10N NaOH (10~22ml)
   
   
   
6. 20X SSC for 1l RNase free
   

   NaCl	Sodium chloride 塩化ナトリウム	58.44	3M	175.3g
   NaOCOCH2C(OH) (COONa)CH2COONa ･2H2O	Sodium citrate クエン酸３ナトリウム（２水和）	294.10	300mM	88.2g
   H2O				800ml

   
   adjust the pH to 7.0 with 1N HCl
   add 1ml of DEPC adjust volume to 1l stir over night
   Sterilize by autoclaving
   
   
   
   
   
7. MetOH series　　100ml each
   100% MetOH l
   75% MetOH/25% DEPC dH2O (3:1)
   50% MetOH/50% DEPC dH2O(1:1)
   25% MetOH/75% PTw (1:3)
   
   
8. MEMFA 10ml *使用直前に作成する
   10×MEM 1ml
   37％Formalin 1mlDEPC DW 8ml
   
   

Optional 普通は使わない

1. levamisol 100mM in DW (stock solution)
   250mg in 10ml (0.5mg/ml=2mM)
   
2. AP-reaction buffer BM purple を使うときはいらない
   0.1M Tris-HCL(pH9.5)
   0.1M NaCL
   autoclaved
   +12.5mM MgCl2 (使用直前に加える）
   

マイクロチューブに分注
1. Denhardt's solution 50× 2mlで for 10times
   Ficoll 5g 1%
   polyvinylpyrrolidone 5g 1%
   BSA(Pentax FractionV) 5g 1%
   DW to 500ml
   Filter through a disposable Nalgene filter.
   Dispense into 25ml aliquots.
   
   Store at -20｡C
   （市販品でも可、和光など）
   
   
   
2. ホルムアミド原液　和光脱イオン済み (原液は凍っているので湯煎で溶かす)
   Make 5~10mls aliquots and store at -20｡C
   
   
3. MAB-B stock solution (10% Boehringer-Mannbeim blocking reagent in MAB)
   
   Dissolve in MAB by gently heating in microwave, then autoclave.
   Aliquot into tubes and freeze at -20C
   
   
4. heparin (100mg/ml) 10μl
   
   
   
5. RNase A 10mg/ml RNase （Treatment をするときにのみ使う。）
   
   Buy solution, its safer than dissolve the powder.
   RNase Aはこの濃度の溶液を買った方が安全
   
   10mM Tris-HCl 15mM NaCl pH7.5 のバッファーにRNase A を入れ、沸騰した100お湯で湯煎して溶かす。
   冷ますときには、お湯につけたまま自然に冷える。急冷すると沈澱を生じてしまう。
   
   
   
   
6. Pro K stock solution: 10mg/ml (or 1mg/ml) Proteinase K
   
   
   
   
7. Sheep serum
   
   Inactivate by heating at 56｡C for 30 minutes
   Make 2ml aliquotes and store at -80｡C.
   
   56℃ で30分処理し、2mlずつ分注しておく。
   
   
8. tRNA
   Torula RNA (Type VI, Sigma R 6625) 200mg を20mlのDWにとかした後(非常に溶けにくい）20ml PCI抽出、及び、20mlクロロホルム抽出を行い、上清をそのまま1mlずつ分注しておく。
   濃度はほぼ10mg/mlになっているはず。

　
1. 10％ Tween 20
   Tween20 1ml
   DW　　　　 9ml
   
   
   
2. 10% CHAPS
   CHAPS 1g
   DEPC DW 9ml
   
   
   
3. 10X MEM stock soln. for 100ml RNase free（遮光保存）
   

   MOPS	209.27	1M	20.93g
   EGTA	380.35	20mM	0.76g
   MgSO4･7H2O	246.48	10mM	0.25g
   H2O			make up to 100ml

   
   adjust pH to 7.4 after you disolve MOPS
   should be autoclaved
   
   注意：順番によってはEGTAは解けにくいので混ぜる時はpH をあわせてから
   
   
   
   
4. 0.1M TEA(triethanolamine) pH7〜8 (Better to prepare freshly.) for 100ml
   
   TEA 1.5g (1.33ml at 20℃)
   DW 98ml
   conc. HCl 0.5ml　（濃塩酸）
   → Check the pH then treat with DEPC
   
   Prepare 100ml X 2 bottles
   
   
   
5. 4% formaldehyde in PTw
   10% formaline in PTw
   

1. Embryoをシステインで処理して脱ゼリーする。
2. 嚢胚・神経胚はビテリン膜を取り除き、尾芽胚は0.01% MS222かクロロホルムで麻酔する。
3. ＭＥＭＦＡ　１.5〜２ｈｒ　Ｒ.Ｔ.で固定。
   　　　　　ＭＥＭＦＡ　　　 10×ＭＥＭ 1ml
   　　　　　　　　　　　　　　Formalin 1ml
   　　　　　　　　　　　　　　DEPC H2O 8ml の割合で混ぜる。
   
   脱色の必要があれば以下のステップを加える。
   
   
4. 10% H2O2/MeOH（H2O2：MeOH＝1：2）　３ｍｌで６hous 蛍光灯下 （多少動物極の色素を残しても良い場合 3 hours ）
5. 100% MeOH -20℃で保存
   

H.S.: hybridization solution for 10ml (for 4~5 samples, 2.2ml for one sample)

formamide	5ml	50%
SSC(20×)	2.5ml	5×
heparin (100mg/ml)	10μl	100μg/ml
Denhardt's (50×)	200μl	1×
Tween 20 (10%)	100μl	0.1%
CHAPS (10%)	100μl	0.1%
tRNA(10mg/ml)	100μl	100μg /ml
0.5M EDTA pH8.0	200μl	5mM
DEPC-dH2O	1.79ml


store at 4℃

1. Pre-treatment 前処理

   RNase free conditon
   

   1. 100mls of 100% MetOH 5 min with agitation
      
      
      固定した胚を100%メタノールに浸したバスケットに移して5分ゆっくりと振蘯。
      胚の移動には、先をカットしたブルーチップか、先をカットしたパスツールピペットを用いる。
      
      
   2. 100mls of 75% MetOH/25%DEPC-dH2O 5 min with agitation on a mild mixer
      
      
      75% メタノール25%DEPC蒸留水で5分ゆっくりと振蘯
      
      
      
   3. 100mls of 50% MetOH/50% DEPC-dH2O 5 min with agitation on a mild mixer
      
      
      50% メタノール50%DEPC蒸留水で5分ゆっくりと振蘯
      
      
      
   4. 100mls of 25% MetOH/75% PTw 5 min with agitation on a mild mixer
      
      
      25% メタノール 75% PTwで5分ゆっくりと振蘯
      
      
      
   5. 100mls of PTw 5 min X 3
      
      
      
      PTwで5分ゆっくりと振蘯　3回繰り返す。
      
      
      Pro K in PTw を作っておく、ProK stock(10mg/ml)をPTw1mlあたり1μl加える。
      ProK (10μg/ml) 1 sample あたり0.5ml
      
      
      
      
2. ProK treatment
   
   
   
   1. Transfer the baskes to 15ml round-bottom polypropylene tubes containing
      0.5ml of 10μg/ml Proteinase K in PTw.
      
      
      0.5ml の10μg/ml Proteinase K PTw溶液の入った15mlの丸底ポリプロピレンチューブにバスケットを移す。
      
      
      
   2. Incubate 5~10minutes at room temp. agitating occasionally by gently tapping the side of the test tube rack.
      
      
      ときどき優しくタッピングで混ぜながら、5~10分室温でインキュベートする。
      
      （胚がもろくなるので原腸胚 は早めに反応を停止する）
      
      
      
   3. Transfer the baskets back to rack sitting in 100mls PTw Just rinse
      
      
      バスケットをPTwにつけてあるラックに戻して軽く洗う。
      
      
      
   4. 100mls of 0.1M TEA 5min with agitation
      (distroy endogenous alkaline phosphatase)
      
      
      100mls の0.1M TEAで 5分ゆっくり振蘯しながら洗浄する。
      （内在性のアルカリフォスファターゼを分解する）
      
      
      
   5. 100mls of 0.1M TEA 5min with agitation
      
      
      
      100mls の0.1M TEAで 5分ゆっくり振蘯しながら洗浄する。
      
      
      
   6. Add 250μl of acetic anhydride 5min with agitation
      
      
      250μlの無水酢酸を加えて 5分ゆっくり振蘯しながら洗浄する。
      （アミノ残基をアセチル化し、プローブの非特異的な結合を防ぐ。）
      
      
      
   7. Add 250μl of acetic anhydride 5min with agitation
      
      
      さらに250μlの無水酢酸を加えて 5分ゆっくり振蘯しながら洗浄する。
      
      
      
   8. 100mls of PTw 5min with agitation X 2
      
      
      PTwで5分間振蘯しながら洗浄する。2回繰り返す。
      
      
      
      
   9. 100mls of 4% formaldehyde in PTw 20min with agitation
      
      
      4% ホルムアルデヒドPTw溶液で20分間振蘯しながら固定する。
      
      
      
   10. 100mls of PTw 5min with agitation X 5
       
       
       PTwで5分間振蘯しながら洗浄する。５回繰り返す。
       
       
       
3. Hybridization
   
   1. Transfer the baskets to 15-ml snap-cap polypropylene tubes containing PTw 500μl+H.S 125μl, then agitate 5min
      
      PTw500μl+H.S 125μlの入った15mlの丸底ポリプロピレンチューブにバスケットを移し、5分振蘯する。
      
      
      
   2. 500μl H.S. 10min at 60℃ with agitation in hybridization oven.
      
      500μl のハイブリダイゼーション液(H.S.) 中で60℃10分間振蘯する。
      
      
      
   3. 500μl H.S. 6 hours at 60℃ with agitation in hybridization oven.
      (pre-hybridization).
      
      
      500μl のハイブリダイゼーション液(H.S.) 中で60℃6時間振蘯しながらプレハイブリダイゼーションをおこなう。
      
      
      <直前にProbe in H.S を作る。
      85℃、2〜3minでdenature →on ice 5min>
      
      
      
      
   4. Probe (0.3~0.5μg) in 500μl H.S.
      
      
      プローブ入りのハイブリダイゼーション液に移す。
      
      
      
   5. Agitate overnight (12~16 hours) at 60℃ in hybridization oven.
      
      振蘯しながら一晩ハイブリダイゼーションをおこなう。
      
      
      
      

• 2 X SSC 300~500 ml 60｡C
  
• O.2 X SSC 200~300ml 60｡C
  
• MAB-B
  

準備：

2X SSC 300ml を60℃に温めておく。 （ウォーターバスが良い）

0.2X SSC 200mlを60℃に温めておく。（ウォーターバスが良い）

• 4 洗いとブロッキング
  
  
  1. プローブの入ったH.S.を回収する。
     
     
  2. 500μl H.S. 10 min at 60℃ with aggitation in hybridization oven.
     
     
     
  3. 100mls of 2×SSC　20min at 60℃　×3
     
     
     バスケットをラックに戻して60℃の100ml 2×SSCで20分洗う。3回繰り返す。ウォーターバスを使う。また、温度低下を避けるためにポリ容器の蓋をしておく。
     
     
     
  4. 100mls of preheated 0.2X SSC and agitate for 30 minutes at 60℃
     
     
     
     
  5. 100mls of preheated 0.2X SSC and agitate for 30 minutes at 60℃
     
     
     
     
  6. 100mls of MAB (maleic acid buffer). Agitate for 15minutes at room temperature.
     
     
     100mls のマレイン酸バッファーで室温で振蘯しながら15分間洗浄する。
     
     
     
     
  7. 100mls of MAB (maleic acid buffer). Agitate for 15minutes at room temperature.
     
     
     MAB-Bを用意しておく（シャーレ用は10~15ml程度）。→MAB-B stock solution をMABで5倍希釈
     
     
     
     
  8. Transfer the embryos to glass vials containing O.5ml of MAB-B (MAB containing 2% BM Blocking reagent).
     
     Agitate 1 hour at room temperature
     1時間室温でゆっくりと振蘯する。
     
     
     <胚をバイアルに移すときは、先ずMAB-Bをガラスシャーレに満たしておいて、そこにバスケットから胚をシャーレに移す。>
     
     ＜この間にMAB-B containing 20% heat-inactivated sheep serum を用意しておく。MAB-B stock : serum : MAB =1:1:3 1 ml for 1 sample ＞
     

     　

  9. Aspirate off the solution and replace with 0.5mls MAB-B containing 20% heat-inactivated sheep serum.
     In order to prevent destruction, keep the embryos submerged.
     
     Incubate for 1hour at room temperature with agitation.
     
     
     <完全に液を除く必要はない。胚は壊れやすくなっているので、液に浸っている状態まで液を残しておいて、液を加える。液は、バイアルの壁面をつたうようにして注ぐ。以下同様に操作。>
     
     
     室温で1時間振蘯しながら処理する。
     
     
     
  10. Remove solution by aspiration and add 0.5ml MAB-B/20% sheep serum containing 1/2000 dilution of alkaline phosphatase-conjugated anit-DIG antibody.
      
      Incubate overnight with agitation at 4℃ (in a cold room).
      
      
      液を除き、1/2000の濃度で「アルカリフォスファターゼを結合させた抗DIG抗体」を含んだ MAB-B/20% sheep serum 0.5ml を加える。
      
      
      4℃ で一晩反応させる。

  
  
  

• 5 Antibody wash
  
  
  1. Aspirate off the antibody solution and rinse embryos in MAB.
     
     抗体液をのぞき、1ml のMABで5分程度洗う。（２回ほど洗った方が良い場合がある。）
     
     
     
  2. Fill vial with MAB and agitate slowly for 1hour at room temperature. X5
     
     MAB でバイアルを満たし、1時間ゆっくりと振蘯しながら洗う。
     これを全部で5回繰り返す。
     
     
     
• 6 Coloring reaction with BM purple
  
  
  1. Remove the MAB and add 0.5 ml BM purple cover with alminum foil and incubate for 5min.
     ピペットマンを使ってMAB を除き、0.5ml のBM purple（アルカリフォスファターゼの基質）を加え、アルミホイルで遮光してゆっくりと5分おく。
     
     
  2. Remove BM purple and add 0.5 ml of new BM purple.
     
     BM purple を新しいものに換える。
     
     
  3. Cover the vial with alminum foil to cut lights
     
     アルミホイルでカバーをして遮光し、発色させる。
     
     
  4. Check the embryos for staining repeatedly and stop the reaction when the staining condition is apropriate with 1ml of MEMFA or 4% formaldehyde in PBS.
     
     ときどき発色の具合を確かめ、適当な時間でMEMFA か 4% formaldehyde PBSを加えて発色を止める。だいたい4時間を目安として発色の具合を確かめ、バックが高くなければ20時間程度発色させても構わない。しかし、probeによっては1時間以内に発色が始まるものもあるので注意する。
     
     
  5. Store in Methanol.
     
     メタノール中で保存する。
     
     

  
  

• 6ーA, 発色 (NBT,BCIP使用）
  

  AP-reaction Buffer / 1mM levamizol 2ml 5min × 2
  NBT4.5μl/ml +BCIP 3.5 μl /ml in AP-reaction Buffer 1ml
  5ml~1day
  actin probe で2〜3hr
  N-CAM・Sek で3〜4hr
  goosecoid で4〜5h
  MEMFA 2ml 2~3hr
  MetOH
  
  

• 6ーB, 発色 (蛍光基質使用）
  
  Buffer ( 100mM tris-HCl / 100mM NaCl / 10mM MgCl2, pH8.0 →フィルターで濾過 )
  3ml 30min × 2
  HNPP-Fast Red TR反応液で発色 3ml 30min
  
  HNPP (10mg / ml in DMF) 30μl
  Fast Red TR (25mg / ml in DW) 30μl →フィルターで濾過
  Buffer 3ml
  　　　
  　　　 BufferでWash 3ml 5min
  　　　 発色 3ml　　　　 30min
  BufferでWash 3ml 5min× 2
  
  

*発色は暗所でおこなう

1. Linearize 20microgram plasmid DNA with an enzyme which cuts 3' to the transcript of interest.
2. PCI extract the DNA three times.
3. Back-extract the organic layers with DEPC-treated H2O and combine.
4. Chloroform extract once.
5. Isopropyl alchoohol precipitae with NH4OAc, pellet the DNA by centrifuge and discard supernatant.
6. Wash with RNase free 70% ethanol and dry.
   
   注意：制限酵素には、5'突出末端を生じる酵素を用いる。3'突出末端の場合RNA polymerase がDNA から離れにくくなり、転写効率が非常に悪くなる。

In vitro transcription of probes

1. Resuspend DNA in 10μl of DEPC-H2O
2. Check DNA concentration
3. Mix the following (total volume 20μl)
   2~4μg of DNA
   4μl 5X in vitro stanscription buffer
   2μl 10X DIG-rUTP/rNTP
   1μl 0.1M DTT
   1μl RNA Guard
   1μl RNA polymerase
   DEPC-H2O to20μl
4. Incubate at 37｡C for 2 hours.
5. Add 1 μl RNase-free DNAse I and incubate 37｡C for 30 minutes.
6. Add
   15μl NH4OAc
   115μl DEPC H2O
   150μl Isopropyl alcohol
7. Mix and put in -20｡C for 1hour.
8. Spin in microfuge at 4｡C for 10minutes
9. Discard sup. and wash with RNase free 70% ethanol
10. Dry briefly the pellet and resuspend in 10~20μl of DEPC-H2O
    
    注：ROCHEのDIG RNA Labeling kit を用いてもよいが、DNAse I 処理を行った後必ず酢酸アンモニウムで沈澱させるか、ゲルろ過のスピンカラムを使って未反応のNTPsを除く。除かないと、非特異的な発現が出てしまう。

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