胚の固定と標本の作成

尾芽胚やおたまじゃくしは泳ぐことができ、動きまわることがある。そこで観察しやすくするために、胚を0.01-2% MS222(tricaine;3-aminobenzoic acid ethyl ester;Etyl m-aminobenzoate)もしくはクロロホルム飽和水溶液を滴加して麻酔するか、固定液で固定をおこなう。

MS222は1%のストックソリューションをつくっておき、4℃で保存。使用時に100倍希釈する。

クロロホルム飽和水溶液は、密閉できるビンに蒸留水を入れ数mlのクロロホルムを加えて激しく振った後一晩放置してつくる。この上澄みを用いる。加えすぎると胚が溶けるので注意する。
1. プラスチックシャーレに0.01%MS222 0.1X MMRを用意し、胚を移す。
   (6cmシャーレの場合)0.1XMMR 10mlに0.1mlの1% MS222 を加える。
2. 数分放置し、シャーレを揺すってみて麻酔が効いているかどうかを確認する。
3. 麻酔した胚をブアン液に移し、30分固定する。固定後胚を70%エチルアルコールに移しておくと保存できる。この固定標本は、パラフィン標本の作成に使用できる。

　実体顕微鏡かルーペをつかって標本をつくるべき発生段階の胚を各ステージ10個ずつくらい選ぶ。選んだ胚の発生段階は発生段階表を参考にし、正確なステージの番号を記録しておく。選んだ胚は20〜50%スタインパーグ液を満たしたプラスティックディッシュに移し、ステージを示したテープを貼っておく。

　　サンプリングする発生段階
胞胚 st.7-9
原腸胚 st.10-12 できればst10-10.5がよい
神経胚 st.17-23
尾芽胚 st. 28-39
オタマジャクシ st. 45~

＜固定＞
　生きている動物をなるべく生きたときの形態を保ったままのかたちで標本にするために固定をおこなう。固定液にはいろいろな組成のものがあるが、ブアン液を使用する方法について述べる。
　ブアン液(Bouin's solution)の組成
　ピクリン酸飽和水溶液：ホルマリン：酢酸＝15：5：１
　先ほど選んだ胚をブアンの入ったサンプル管に移し30分固定する。このときできるだけ水が入らないように気をつける。　このとき、尾芽胚とおたまじゃくしはクロロホルム飽和水溶液であらかじめ麻酔をしておく。

＜脱水・透徹＞
　ブアン液は水容性なので固定した標本をそのままパラフィンに入れてもしみこまない。そこで、徐々に濃度の高いエタノールに移して水を除いてやる。エタノールもパラフィンに溶けないので、ブタノールに移す。ブタノールはエタノールにもパラフィン（ロウ）にも溶ける。

　固定→70％エタノール→90％エタノール→100％エタノール→
　エタノールブタノール（1：1）→ブタノール１→ブタノール２

　各液30分以上（アフリカツメガエル初期胚の場合。一般にサンプルの大きさで時間は異なる。）

　切片標本は、固定したサンプルを薄く切って染め、透過型の顕微鏡で観察できるようにしたものである。標本そのままでは薄く切ることが困難なのでパラフィンといしょに切る必要がある。そのためにパラフィンに埋め込むのが包埋である。脱水、透徹をおこなったサンプルをパラフィンオーブン中でブタノールパラフィンに移し、次にパラフィンに移してやる。パラフィンの浸透したサンプルはパラフィンといしょに、紙でつくったかたの中に流し込みピンセットで方向を整えて固める。

　ブタノールパラフィン(30分)→パラフィン１(30分)→パラフィン２(30分)→包埋

＜方法＞

1. 脱水の終ったサンプルをブタノールの入ったサンプル管ごとパラフィンオーブン（60〜65℃）に入れて20〜30分ほど温めておく。これは、サンプルをブタノールパラフィンに移すときにサンプルの低温でパラフィンが固まるのをふせぐためである。
2. サンプル管をパラフィンオーブンに入れると同時にホットプレートの電源を入れておく。
3. ブタノールパラフィンの入ったシャーレとサンプルの入ったサンプル管を出して、ホットプレートの上にのせる。
4. ピペット1を使って、温めたサンプルをシャーレの中のブタノールパラフィンに移す。サンプルを移すときは、ピペット1の先がブタノールパラフィンにつかないようにして一滴のブタノールと共にサンプルをブタノールパラフィンに移す（図２）。ブタノールを使ったピペット中にブタノールが残らないように、キムタオルに余分なブタノールを吸わせる。
5. すべてのサンプルを移し終ったシャーレはパラフィンオーブンに移しを30〜60分かけてブタノールパラフィンをサンプルに浸透させる。
6. ブタノールパラフィンとハードパラフィン１のシャーレをホットプレートの上にのせる。
7. ピペット２を使ってブタノールパラフィン中のサンプルをハードパラフィン１に移し30〜60分浸透させる。この時は３、と違ってピペットの先はブタノール１の中につけてよい。ピペットが冷えているとパラフィンが固まるので、使用直前にアルコールランプであたためてやる。ただし、ブタノールは引火し易いので、使用したあと、ピペット中にブタノールパラフィンが残っていないように余分なブタノールパラフィンはブタノールパラフィンのシャーレにもどし、それでも残った分はキムタオルに吸わせる。
8. 6、7と同様にして、サンプルをハードパラフィン１からハードパラフィン２に移し30〜60分浸透させる。
9. 流しに水の入った洗面器を用意する。
10. 包埋用の紙の箱の裏に、班の名前（自分の名前でも可）とサンプルのステージを鉛筆で記入する。また、紙の箱の内側には矢印（→）を書き入れる。これは切片を作るときの方向を知るためである。
11. 絵の具筆を使って、包埋用の紙の箱にグリセリンアルコールをぬる。
12. ハードパラフィン2のシャーレをホットプレートの上に出す。
13. 使い古したスライドグラスの上に紙の箱を置き、温めたピペットで箱の2/3ほどまでパラフィンを入れる。13〜15はできるだけ手早くやる。
14. 温めたピペット3を使ってサンプルを紙の箱のパラフィンの中に移す。
15. 移したサンプルはそのままだと箱の底に沈んでしまって切片が作りにくくなる。そこで、アルコールランプで温めたピンセットを使って、つかんでは持ち上げてはなす操作を繰り返す（この時、サンプルを壊し易いので注意。あらかじめピンセットで小さいものをつかむ練習を少ししてからやったほうがよい。）。そして、最終的には、サンプルが底から少し上の位置でしかも切片が切り易い方向に位置をそろえる。方向の目安として矢印を使う。矢印は、パラフィンが固まった後に箱をはずすとパラフィンに移るので、外からわかる。
16. パラフィンの表面が固まる迄少し待って、スライドグラスごと水につけて冷やしてかためる。このとき、ゆっくりとつけないと水がパラフィンの中に入り込んでしまう。また、表面のかたまりかたが不十分だと同様にトラブルに見舞われる。
17. 20〜30分ほどパラフィンを固めた後、キムタオルの上で一晩、紙を乾燥させる。
    18、乾燥した包埋片は外の紙ごと所定の箱に入れて来週まで保存する。
    

注意点、

○固定・脱水の終ったサンプルは硬くて壊れ易い。そのため、ピンセットなどでつまむことがむつかしい。ブタノールまで脱水をおこなったサンプルを先を太くしたパスツールピペットを使って、少量の液とともにブタノールパラフィン、パラフィン１、２、と移し換えてやる。
○パラフィンオーブンは一台しか使わないので、パラフィンの前の作業は各班順番におこなう。
○パラフィンオーブン中の温度が下がると中のパラフィンが固まってしまうのでドアの開閉はできるだけすみやかにおこなう。
○パラフィンは熱いので適宜用意した手袋を使用する。

マイクロトームを使って、包埋したサンプルをパラフィンごと薄切りにし、切片を作成する。以下に手順の概要を示す。

1. 包埋したサンプルをトリミングする
2. アルコールランプで熱したスパチュラを使って、包埋片を台木に取り付ける。
3. 包埋片のついた台木をマイクロトームに取り付ける。
4. 8μmの厚さで包埋片から切片を作成する。
5. 切片の順番を間違えないようにしながら黒い紙の上に並べていく。このとき鼻息などで吹き飛ばさないように注意する。（マスクなどを使ってもよい。）

注意点、
○包埋したサンプルは、外から見えにくいのでトリミングするときにかみそりで傷をつけないように注意する。
○切片を切るときにどの方向に切るかを確認して、台木に取り付ける。
○切片は、薄くて弱い風でも吹き飛んでしまうので、鼻息などで吹き飛ばさないように注意する。
○伸展するときに、並べた切片が泳いでいって配列がくずれることがあるので、ある程度水が乾くまで伸展器のそばについていて、ピンセットでかたちを整える。

＜トリミング＞

1. 切片を切る方向を決める。
2. メスか片刃の安全カミソリを使って包埋片から余分なパラフィンを切取る。ただし、はじめは整形のためにある程度パラフィンの余分を残して大きめに切っておく。（サンプルの方向がわからなくならないように気をつける）
3. かたちを整形して、ミクロトームに取り付けるのに手ごろな大きさにする。台木に取り付ける方向のパラフィンは少し余分に残しておく。

＜台木への取り付け＞

1. トミリングした包埋片を取り付ける台木の面を確認する（方向を間違えるとミクロトームに取り付けられないことがある。）。
2. アルコールランプで熱したスパチュラを使って包埋片を台木に取り付ける。

＜ミクロトームによる切片の作成＞

1. ミクロトームをきれいにし、台木を取り付けるところが十分後ろに来るように歯車をもどしておく。
2. 台木をミクロトームに取り付け、取り付け台の角度を調整する。
3. ミクロトームの刃をミクロトームに取り付ける。この刃は非常によく切れるので取扱には十分注意する。
4. ミクロトームのストッパーをはずして、包埋片の先端が刃の直前に来るように刃の位置を調整する。
5. 刃の位置を固定し、7〜10μmで切片を作成する。
6. 切片はリボン状につながって来るので、筆で支えながら切る。
7. 適当な長さになたったら、途中で切片リボンを切って黒い紙の上に順番に並べる。このとき、手でさわったり、鼻息で吹き飛ばさないように注意。

パラフィン切片のままでは、染色をおこない、顕微鏡下で観察するのに不都合なので、スライドグラス上で伸展し貼り付ける。
1. 伸展器の温度（使用するパラフィンの融点より10℃程度低め。今回は45〜50℃くらい）をセットする。
2. 脱脂洗浄の終ったスライドグラスを用意し、70%エタノールをしみこませたキムワイプでふく。
3. スライドグラスの上に蒸留水を一滴垂らし、全体に広げる。このときスライドグラスの表裏を間違えないように注意。
4. リボンを約4〜5cmの長さに切って、ピンセットと小さい筆を使ってスライドグラスの上に切片が順番に並ぶようにそろえる。余分な水をキムワイプで除く。
5. スライドグラスのフロストの部分にサンプルの情報を鉛筆で記入する。
6. 伸展器の上にのせ、伸展させる。ほぼ乾いたら、そのまま一晩乾燥する。
7. 伸展器の上に一晩おいて、切片を完全に乾燥させスライドグラスに貼り付ける。

スライドグラスに張り付けた切片はそのままでは、半透明で観察しにくい。そこで、色素で染色し観察しやすくする。今回は染色用の色素としてヘマトキシリンとエオシンを使って染色する。ヘマトキシリンは水容性なので、キシレンで脱パラフィンし、エタノールシリーズで脱アルコールをおこなった後、マイヤーのヘマトキシリンで染色する。エタノールシリーズで脱水し、95%エタノール0.5%エオシンで二重染色をし、キシレンを通した後、封入剤で封入する。染色後の標本では、核がヘマトキシリンで青紫に染色され細胞質はエオシンで赤っぽく染色される。また、細胞内の卵黄の多少や器官によっても染色性が少しずつ異なる。染色時間によっても標本のできがことなるので、本来は最適条件を調べなければいけないのだが、今回は予め決めた時間染色をおこなう

　

＜材料と器具＞

染色ビン、染色かご、かご用針がね（自作したもの）、ピンセット、柄つき針、カバーグラス、伸展させた切片標本、封入剤、キムタオル、ペーパータオル、水洗用容器、カバーグラス用おもし、台木

＜方法＞

1. スライドグラスを染色用バスケットに入れる。このとき、切片のはりつけてある側（表）をそろえておく。パラフィンを溶かしてしまった後では裏表が見分けにくくなるので注意する。
2. 時間と順番のとおりに染色バスケットを移してやる。
3. 最後のキシレンのところまでいったら、スライドグラスを切片ののっている方を上にしてペイパータオルの上に置く。
4. 封入剤（当研究室ではマツナミのMXというのを使う）をＴの字になるようにたらす。カバーグラスの端ををＴの横棒の所につけて、静かにおろし封入する。

注意点、

○染色液を使うので服につけないように注意する。
○切片の貼り付けてある側を間違えないようにする。フロストの面の粗い方が表。

実験形態学