ホールマウント　インシチューハイブリダイゼーション

• 基本的な注意
• 前日までの準備
  • 器具の滅菌
  • 試薬の作成
    • A. 室温保存
    • B. 冷凍保存
    • C. 冷蔵保存
  • 胚の固定
• 一日目午前試薬作り
• 一日目午後
  • 前処理
  • ProK 処理
  • ハイブリダイゼーション
• 二日目午前　試薬準備
• 二日目午後　PROBE 回収
• 三日目

1. RNase の汚染が無いように厳重注意
2. 器具は全て滅菌か使い捨て容器使用
3. 操作は必ず手袋着用、特にサンプルチューブは素手で触らない。
4. 試薬の量と条件（温度など）を間違えないこと

• 器具の滅菌
  ガラス器具　乾熱滅菌
  プラスチック容器（主に使い捨て）
• 試薬の作成
  ラベリング
  作った試薬には試薬名と調製日を書いておく。
  スペースがあれば、制作者名も記入
• 胚の固定
• その他の実験条件
  実験室　洗浄 まではRNase を使用している部屋は使わない。
  手袋　　洗浄 まではサクラメンの手袋着用。
  温度　　ハイブリダイゼーションと洗浄の温度は厳守、試薬はあらかじめ所定の温度にしておく

1. DEPC H2O
   2L くらい作っておく
   1L の蒸留水にDEPC（２炭酸ジエチル）1ml を加えて一晩スターラーで撹拌したのちオートクレーブ(121｡C 20 分）＜DEPCは発ガン性が疑われているので、なるべくドラフトで扱う。DEPCの保存は冷蔵庫＞
   
2. 10× PBS for 1l
   

   NaCl	Sodium Chloride 塩化ナトリウム	58.44	1369mM	80g
   KCl	Potassium Chloride 塩化カリウム	74.55	26.8mM	2g
   Na2HPO4	Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous リン酸一水素ナトリウム（無水）	141.96	81.0mM	11.5g
   KH2PO4	Potassium Phosphate, Monobasic リン酸二水素カリウム（無水）	136.09	14.7mM	2.0g
   H2O				800ml

   
   adjust the pH to 7.4 then make up to 1l

   autoclave
   

3. PTw for 1l RNase free
   

   10× PBS	100ml
   Tween 20 (10%)	10ml(0.1%)

   autoclave
   
   
   
4. PBT (BSA-) Final RNase free MAB Buffer を使うときはいらない
   

   10× PBS	1l
   Triton(10%)	10ml (0.1%)
   BSA	2g (2mg/ml)使用直前に加える

   
   
   
5. MAB(Maleic acid buffer)
   

   Maleic acid	116.1	100mM	11.61g
   NaCl	58.44	150mM	8.77g
   H2O			make up to 1l

   
   pH to 7.5
   
   
   
6. 20X SSC for 1l RNase free
   

   NaCl	Sodium chloride 塩化ナトリウム	58.44	3M	175.3g
   NaOCOCH2C(OH) (COONa)CH2COONa ･2H2O	Sodium citrate クエン酸３ナトリウム（２水和）	294.10	300mM	88.2g
   H2O				800ml

   
   adjust the pH to 7.0 with 1N HCl
   add 1ml of DEPC adjust volume to 1l stir over night
   Sterilize by autoclaving
   
   
   
7. 10X MEM stock soln. for 100ml RNase free
   

   MOPS	209.27	1M	20.93g
   EGTA	380.35	20mM	0.76g
   MgSO4･7H2O	246.48	10mM	0.25g
   H2O			make up to 100ml

   
   adjust pH to 7.4 after you disolve MOPS
   should be autoclaved
   
   注意：順番によってはEGTAは解けにくいので混ぜる時はpH をあわせてから
   
   
   
8. 10% Boehringer-Mannbeim blocking reagent stock
   
   Dissolve in MAB by gently heating in microwave, then autoclave.
   Aliquot into tubes and freeze at -20C
   
   
9. MetOH series
   100% MetOH l
   75% MetOH/25% DEPC dH2O (3:1)
   50% MetOH/50% DEPC dH2O(1:1)
   25% MetOH/75% PTw (1:3)
   
   
10. levamisol 100mM in DW (stock solution)
    250mg in 10ml (0.5mg/ml=2mM)
    
11. AP-reaction buffer
    0.1M Tris-HCL(pH9.5)
    0.1M NaCL
    autoclaved
    +12.5mM MgCl2 (使用直前に加える）
    
12. MEMFA 10ml *使用直前に作成する
    10×MEM 1ml
    37％Formalin 1mlDEPC DW 8ml
    

マイクロチューブに分注
1. Denhardt's solution 50× 2mlで for 10times
   Ficoll 5g 1%
   polyvinylpyrrolidone 5g 1%
   BSA(Pentax FractionV) 5g 1%
   DW to 500ml
   Filter through a disposable Nalgene filter.
   Dispense into 25ml aliquots.
   
   Store at -20｡C
   （市販品でも可、和光など）
2. ホルムアミド原液　和光脱イオン済み
3. heparin (100mg/ml) 10μl
4. RNase A 10mg/ml
5. Pro　K 10mg/ml Proteinase K
   

　
1. 10％ Tween 20
   Tween20 1ml
   DEPC DW 9ml
   
2. 10% CHAPS
   CHAPS 1g
   DEPC DW 9ml
   
3. 4% formaldehyde in PTw
   10% formaldehyde in PTw
   
4. 0.1M TEA(triethanolamine) pH7〜8 Better to prepare freshly.
   TEA 7.5g (6.67ml at 20℃)
   DEPC DW 400ml
   conc. HCl 2.5ml
   → adjust volume to 500ml
   

1. Embryoをシステインで処理して脱ゼリーする。
2. 嚢胚・神経胚はビテリン膜を取り除き、尾芽胚は 0.02% MS222 もしくはクロロホルムで麻酔する。
3. ＭＥＭＦＡ　１.5〜２ｈｒ　Ｒ.Ｔ.で固定。
   　　　　　ＭＥＭＦＡ　　　　10×ＭＥＭ 200μｌ
   　　　　　　　　　　　　　　　Formalin 　200μｌ
   　　　　　　　　　　　　　　　ＤＷ　　　　1600μｌ
4. １００％ＭｅＯＨ　−２０℃で保存

脱色する場合

1. １０％Ｈ２Ｏ2/ＭｅＯＨ（Ｈ２Ｏ２：ＭｅＯＨ＝1：2）　３ｍｌで６ｈｒ蛍光灯下 （3ｈｒ　多少動物極の色素を残しても良い場合 ）
2. １００％ＭｅＯＨ　−２０℃で保存
   

H.S.: hybridization solution for 10ml (for 4~5 samples)

formamide	5ml	50%
SSC(20×)	2.5ml	5×
heparin (10mg/ml)	100μl	100μl/ml
Denhardt's (50×)	200μl	1×
Tween 20 (10%)	100μl	0.1%
CHAPS (10%)	100μl	0.1%
tRNA(10mg/ml)	100μl	100μg /ml
DW	2ml


store at 4℃

1. Pre-treatment 前処理

   RNase free conditon
   

   1. 100mls of 100% MetOH 5 min with agitation
      （固定した胚を100%メタノールに浸したバスケットに移す。）
   2. 100mls of 75% MetOH/25%DEPC-dH2O 5 min with agitation
      
   3. 100mls of 50% MetOH/50%DEPC-dH2O 5 min with agitation
      
   4. 100mls of 25% MetOH/75%PTw 5 min with agitation
      
   5. 100mls of PTw 5 min X 3
      Pro K in PTw を作っておく
      ProK (10ｵg/ml) 1 sample あたり0.5ml
      
      
2. ProK treatment
   
   1. Transfer the baskes to 15ml round-bottom polypropylene tubes.containing
      0.5ml of 10ｵg/ml Proteinase K in PTw.
      
   2. Incubate 5~10minutes at room temp. agitating occasionally by gently tapping the side of the test tube rack.
      （胚がもろくなるので原腸胚 は早めに反応を停止する）
      
   3. Transfer the baskets back to rack sitting in 100mls PTw Just rinse
      
   4. 100mls of 0.1M TEA 5min with agitation
      (distroy endogenous alkaline phosphatase)
      
   5. 100mls of 0.1M TEA 5min with agitation
      
   6. Add 250ｵl of acetic anhydride 5min with agitation
      
   7. Add 250ｵl of acetic anhydride 5min with agitation
      
   8. 100mls of 4% formaldehyde in PTw 20min with agitation
      
   9. 100mls of PTw 5min with agitation X 5
      
      
3. Hybridization
   
   1. Transfer the baskets to 15-ml snap-cap polypropylene tubes containing PTw 500μl+H.S 125μl, then aggitate 5min
      
   2. 300μl H.S. 10min at 60℃ with aggitation in hybridization oven.
      
   3. 500μl H.S. 6 hours at 60℃ with aggitation in hybridization oven.
      (pre-hybridization).
      
   4. Probe (0.3~0.5μg) in 500μl H.S.
      
   5. Agitate overnight (12~16 hours) at 60℃ in hybridization oven.
      
      <直前にProbe in H.S を作る。
      85℃、2〜3minでdenature →on ice 5min>
      
      

• ２×ＳＳＣ 1l
  
• ０.２×ＳＳＣ 1l
  
  

準備：2X SSC 300mlを60℃に温めておく。

• 4ーA 洗い(ＲNase A使用の場合)
  <4 以降はRNase Aが他の試薬に混ざらないよう、容器を分け、別の部屋で行なう＞
  
  1. プローブの入ったH.S.を回収する。
     
  2. 500μl H.S. 10 min at 60℃ with aggitation in hybridization oven.
     
  3. 2×SSC　20min at 37℃　×3
     
  4. Transfer baskets into 15ml polypropylen tubes containing 20μg/ml RNase A in 2×SSC 500μl 30min at 37℃
     
  5. Transfer baskets back to the rack containing 100mls of 2X SSC and agitate 10minutes
     
  6. 100mls of preheated 0.2X SSC and agitate for 30 minutes at 60℃
     
  7. 100mls of preheated 0.2X SSC and agitate for 30 minutes at 60℃
     
  8. 100mls of MAB (maleic acid buffer). Agitate for 15minutes at room temperature.
     
  9. 100mls of MAB (maleic acid buffer). Agitate for 15minutes at room temperature.
     
  10. Transfer the embryos to glass vials containing O.5ml of MAB-B (MAB containing 2% BM Blocking reagent).
      
      <胚をバイアルに移すときは、2% BM Blocking reagentをガラスシャーレに満たしておいて、先ずそこにバスケットをつけて胚を取り出す。>
      
      
  11. Mix for 1 hour at room temperature
      
  12. Aspirate off the solution and replace with 0.5mls MAB-B containing 20% heat-inactivated goat serum.
      
      
  13. Incubate for 1hour at room temperature with agitation.
      
  14. Remove solution by aspiration and add 0.5ml MAB-B/20% goat serum containing 1/2000 dilution of alkaline phosphatase-conjugated anit-DIG antibody.
      
  15. Incubate with agitation overnight at 4
      

  
  

• 5 Antibody wash
  
  直前にPBTにlevamisolを加える。
  PBT /1 mM levamisol 2ml 10min×2　　60min ×5
  
  1. Aspirate off the antibody solution and rinse embryos in MAB.
     
  2. Fill vial with MAB and agitate slowly for 1hour at room temperature. X5
     
• 6 Coloring reaction with BM purple
  
  1. Remove the MAB and add 0.5 ml BM purple.
     
  2. Cover the vial with alminum foil to cut lights
     
  3. Chech the embryos for staining repeatedly and stop the reaction when the staining condition is apropriate with 1ml of MEMFA or 4% formaldehyde in PBS.
     
  4. Store in Methanol.

  
  

• 6ーA, 発色 (NBT,BCIP使用）
  

  AP-reaction Buffer / 1mM levamizol 2ml 5min × 2
  NBT4.5μl/ml +BCIP 3.5 μl /ml in AP-reaction Buffer 1ml
  5ml~1day
  actin probe で2〜3hr
  N-CAM・Sek で3〜4hr
  goosecoid で4〜5h
  MEMFA 2ml 2~3hr
  MetOH
  
  

• 6ーB, 発色 (蛍光基質使用）
  
  Buffer ( 100mM tris-HCl / 100mM NaCl / 10mM MgCl2, pH8.0 →フィルターで濾過 )
  3ml 30min × 2
  HNPP-Fast Red TR反応液で発色 3ml 30min
  
  HNPP (10mg / ml in DMF) 30μl
  Fast Red TR (25mg / ml in DW) 30μl →フィルターで濾過
  Buffer 3ml
  　　　
  　　　 BufferでWash 3ml 5min
  　　　 発色 3ml　　　　 30min
  BufferでWash 3ml 5min× 2
  
  

*発色は暗所でおこなう

1. Linearize 20microgram plasmid DNA with an enzyme which cuts 3' to the transcript of interest.
2. PCI extract the DNA three times.
3. Back-extract the organic layers with DEPC-treated H2O and combine.
4. Chloroform extract once.
5. Isopropyl alchoohol precipitae with NH4OAc, pellet the DNA by centrifuge and discard supernatant.
6. Wash with RNase free 70% ethanol and dry.
   
   注意：制限酵素には、5'突出末端を生じる酵素を用いる。3'突出末端の場合RNA polymerase がDNA から離れにくくなり、転写効率が非常に悪くなる。

In vitro transcription of probes

1. Resuspend DNA in 10ｵl of DEPC-H2O
2. Check DNA concentration
3. Mix the following (total volume 20ｵl)
   2~4ｵg of DNA
   4ｵl 5X in vitro stanscription buffer
   2ｵl 10X DIG-rUTP/rNTP
   1ｵl 0.1M DTT
   1ｵl RNA Guard
   1ｵl RNA polymerase
   DEPC-H2O to20ｵl
4. Incubate at 37｡C for 2 hours.
5. Add 1 ｵl RNase-free DNAse I and incubate 37｡C for 30 minutes.
6. Add
   15ｵl NH4OAc
   115ｵl DEPC H2O
   150ｵl Isopropyl alcohol
7. Mix and put in -20｡C for 1hour.
8. Spin in microfuge at 4｡C for 10minutes
9. Discard sup. and wash with RNase free 70% ethanol
10. Dry briefly the pellet and resuspend in 10~20ｵl of DEPC-H2O

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