20080123

プラスミドの直線化

＜ユニークサイト＞

制限酵素を使ってプラスミドを直線化するには、プラスミドの制限酵素マップから、プラスミドDNAを一ヶ所でだけ切断する制限酵素を選ぶ必要がある。このとき切断される場所をユニークサイトと呼ぶ。

＜制限酵素１単位は、1時間に1μgのDNAを切断する酵素の量＞

切断に必要な制限酵素の量は、プラスミドDNAの量に比例する。制限酵素の1単位(unit)とは、1時間に1μgのDNAを切断する酵素の量だが、プラスミドDNAは、スーパーコイルになっていて切断しにくい状態のものが多いので、3 - 5倍過剰な量の制限酵素を加える。

以下10μgのプラスミドDNAを10unit/μlの制限酵素で切断する（反応液の総量100μl）例である。

1 プラスミドを切断する制限酵素を選び、使用バッファーの種類と温度を調べる。

2 Heat block かWater Bathの電源を入れ、制限酵素の処理温度にしておく。

3 プラスミドDNA溶液の濃度からDNAを10μg切るのに必要な容量を計算する。

4 プラスミドDNA溶液とバッファーストック10μlと制限酵素3μl (大体30単位くらいに相当）の合計の容量を計算する。

5 100μlから4で計算した容量を引いて必要な滅菌蒸留水の量を計算する。

6 滅菌蒸留水、バッファーストック、プラスミド溶液の順にエッペンチューブに入れる。

7 制限酵素を冷却剤の容器ごと持ってきて、軽く遠心した後フリッピングする。このとき手早くやらないと、温度が上がって制限酵素がダメになるので注意。

8 最後に制限酵素3μlグラムを6の混合液に加えてフリッピングする。

9 所定の温度で2時間切断。

10 3μgほどとって電気泳動して切断を確認する。

11 切断されていればPCI処理でDNAの抽出をおこなう。

フェノール抽出

注意：ここで使うTEは、10mM Tris 1mM EDTA pH8.0

　　　PCI はPhenol TE:Chloroform:isoamylalchohol = 25:24:1 混合液

　　　Phenol TEはTE飽和フェノール

１ 制限酵素で処理したプラスミドDNA溶液に150μlのTEを加える。

２ 250μl の PCI を加えてボルテックス

３ 12000~15000RPM　(TOMYの微量遠心機）で1~3分間遠心する

４ 水相を新しいエッペンチューブにとり、２と３の操作を繰り返す

５ 水相を新しいエッペンチューブにとり、Chloroform を加えてボルテックス

６ 水相をとる。

（ＤＮＡの回収率を上げたいときには、４の操作後、水相を除いた後のPCIに150μl程度のTEを加えて再抽出をおこなう。PCIとChloroformは、一回目の抽出で使ったものをその順番に再度使う。）

７　水相の1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）を加え、2倍量のエタノールもしくは等量のイソプロビルアルコールで沈澱させる。

８　15000rpm で15分遠心後、上清を除き（10ulくらい残っていても良い）、1ml の70% エタノールで洗浄する。

９　15000rpm で5分遠心後、できる限り　70% エタノールを除く。

１０　沈澱を乾燥させ、10~20μlのTEを加えて溶かし、DNA濃度を測定