アフリカツメガエル初期胚からのゲノムDNAの抽出

生物のDNAには遺伝子がコードされている。生命現象を遺伝子から解析するためにはこの　DNAを生物から抽出して解析することが重要となってくる。真核生物のDNA は非常に長く、ヒストンに結合して保護されている。長いDNAの全長を切断することなく抽出することは難しいが、途中で短い断片に切断されたとしても構わないならば、ゲノムDNAの抽出は比較的簡単に行える。PCRによる遺伝子の部分的な増幅など、切断されたDNAを使っても実用上差し支えない実験もある。今回は、分子生物学実験で行った植物のDNAの抽出に引き続き、比較的簡便な方法を使って、動物のゲノムDNAの抽出を行ってみる。なお、今回の方法ではRNAも同時に抽出されるので、あとで、電気泳動によりどのバンドがDNAでどのバンドがRNAかを酵素処理によって調べてみる。

ポイント

○　胚一個体あたり、どのくらいの量のDNAが抽出されるか。

○ 電気泳動後の核酸の染色で明瞭なバンドが観察されるか？

○ どのぐらいの長さのバンドが現れるか？

○ どのバンドがDNAでどのバンドがRNAか？それぞれどのくらいの大きさか？

＜方法＞

A 材料と器具

○　抽出バッファー:

1% SDS, 10mM Tris-HCl(pH7.0~8.0), 10mM EDTA(pH8.0), 10μg/ml Protenase K（保存液は2mg/mlで冷凍保存つくるときには最後に200μlに対して1μl加える。）

○ TE: Tris-HCl 10mM EDTA 1mM pH8.0

○ 7.5M 酢酸アンモニウム pH調整の必要はない

○　中性フェノール:

１. 　フェノール100gにTE 緩衝液を30mlほど入れて溶かす。

２. 　2M Tris-HCl(pH合わせ不要) を2ml,2-メルカプトエタノール02ml,8-ハイドロキシキノリンを0.2g加える。

３. 　良く混ぜて溶かした後、上層に水層ができるまでTEを加える。

○　泳動バッファー: 0.1% BPB 0.1% Xylene cyanol 30%グリセリン（使用時に6倍希釈）。

BゲノムDNAの抽出

１. 　　アフリカツメガエルにホルモン注射をして胚を得る

２. 　　胞胚から神経胚程度の胚を2匹選び1.5mlのチューブ（エッペン）に入れる。

３. 　　ピペットマンを使って、チューブから水分を除く。

４. 　　抽出バッファー200μl（一匹あたり100μl）加える。

５. 　　ピペッティングでホモジナイズする。

６. 　　37℃で1時間おく。

７. 　　中性フェノールを200μl（一匹100μl）加える。

８. 　　ボルテックスミキサーで良く撹拌する。

９. 　　15,000rpm 4℃で5分間遠心する。

１０. 　上清を新しいエッペンに移す。

１１. 　クロロホルムを200μl加える。

１２. 　ボルテックスミキサーで良く撹拌する。

１３. 　15,000rpm 4℃で5分間遠心する。

１４. 　上清を新しいエッペンに移す。

１５. 　7.5M 酢酸アンモニウムを100μl（一匹あたり50μl）加える。

１６. 　エタノールを600μl（一匹あたり300μl）加える。

１７. 　–20℃で20分おく。

１８. 　15,000rpm 4で5分間遠心する。

１９. 　沈澱を吸ってしまわない様に注意してエタノールを除く。

２０. 　70% エタノール1mlを加えて沈澱を洗う。

２１. 　15,000rpm 4℃で5分間遠心する。

２２. 　沈澱を吸ってしまわない様に注意してエタノールを除く。

２３. 　沈澱を乾燥させて20μlのTEに溶かす。（RNA を除きたいときには20µg/ml RNase Aを含んだTEに溶かす。）

C 電気泳動

１． 1%アガロースTAEゲルをつくる。

２． BでつくったDNA溶液の濃度を測定する。

２． 1~2μg程度のDNAを含むDNA溶液量を計算する。5μlを超えないようにする。

３． 5μlから計算したDNA溶液の量を引いた量のTEをエッペンチューブにとる。

４． 泳動バッファーを1μl加える。

５． 計算した量のDNA溶液を加える。

６． 1%アガロースゲル100Vで電気泳動する。このとき電流の極性に注意。（BPBのバンドがゲルの半分を超えるくらいまで泳動）

７． 電源を切ってからミューピッドブルーの入った容器にゲルだけ移し、90秒染色する。

８． 速やかに、70%エタノールで1分間振蘯脱色。これを2回おこなう。

９． 蒸留水で1分脱色（実際はこのときに色素がDNAに結合する）

１０． バンドがはっきり見えるようになったら写真を撮る。