Competent cell の作り方

　

実験の手順

1　500ml 三角フラスコに50mlのSOBを入れる

2　大腸菌ストックを一滴加え、18℃（もしくは室温）で一晩激しく撹拌培養

3　翌朝OD600測定、0.2-1.5であればOK（0.6が最適）

4　氷水上で10分間冷却

5　4℃ 3000rpm で10分遠心

6　上清を除く

7　0℃のTB 17mlに大腸菌を懸濁する

8　4℃ 3000rpm で10分遠心

9　上清を除く

10　0℃のTB 4mlにブルーチップでかき混ぜながら懸濁する

11　0.3ml のDMSO(final0.7%)を加え、氷上に10分放置

12　1mlずつ分注

13　液体窒素あるいはドライアイスエタノール中で10分以上放置

14　指の間で暖めて溶かし、マイクロチューブに10ul ずつ分注

15　直ちに凍結する

　

形質転換

　準備：

○　ヒートブロックを42℃にセットしておく

○　LBプレートを乾燥させておく

○　SOBにMg2+を加えておく　（1/100）

○　氷を用意しておく

○　タイマー、エッペンチューブ、ピペットマン(P1,P20,P200)、チップ、チップ捨て、パラフィルム、油性ペン（黒・赤・青・緑）、

　実験の手順

1　分注してあったコンピテントセルを氷上で溶かす

2　10ulのコンピテントセルに0.5-1ul のDNA を加える

3　氷水中で10分保冷

4　42℃で90秒ヒートショック

5　氷水中で5-10秒急冷

6　20ul のSOBを加える

7　チューブのふたを締め37℃で30-60分激しく振蘯培養

8　2枚のLB plate にそれぞれ4ul と20ulまき、37℃で一晩培養

　

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